近日，jdb电子 刘俊秋教授团队在Advanced Functional Materials上发表了题为“Functionalization-Level-Dependent Transport Activity and Cancer Cell-Activated Characteristic via Polyether-Based Artificial Proton Transport System”的研究论文，提出了一种利用聚醚构建高效人工质子跨膜传输系统的策略，并将该人工质子通道用于抗癌治疗。该体系通过一锅法光诱导铁催化聚醚C—H键烷基化反应合成。通过控制反应时间来调控聚醚的功能化程度，进而调节其两亲性，所得体系表现出可调的传输活性。此外，该系统模拟天然质子通道，能够通过形成多重氢键链高效促进质子传输，同时有效排斥其他离子和水分子。膜片钳测量表明，该体系具有较高的质子传输速率（γ_H⁺ = 97 ± 3 pS，约为天然短杆菌肽A的50%）和显著的质子选择性（P_H+/P_K+ = 106.7, P_H+/P_Na+ = 168.2, P_H+/P_Cl- = 10.6）。与正常细胞相比，癌细胞质膜两侧的质子梯度显著更大，这意味着该质子传输系统可被癌细胞选择性激活并诱导其凋亡。本研究有望加深对天然通道蛋白潜在机制的理解，并为癌症及其他疾病的治疗作出贡献。

天然通道蛋白（NCPs）不仅能高选择性转运相关物质跨过细胞膜，还能响应pH、光照和电压等外界刺激进行功能调控。例如，人电压门控质子通道可在波动条件下有效调节胞内质子外流，进而影响活性氧的产生。然而，这些认识尚不足以揭示NCPs复杂而精细的功能全貌，尤其是其更深层次的运作机制，如非线性构效关系（SARs），这些机制既满足生理需求，又使NCPs能够适应多变环境。人工离子传输系统（AITSs）为阐明NCPs结构与功能的关联提供了可行途径，并有望用于治疗通道相关疾病。虽然已有大量工作致力于开发此类系统，但当前基于对NCPs有限认知而设计的AITSs可切换传输活性，主要依赖于引入刺激响应性基团，从而将研究局限于既有认知范畴，难以实现根本性突破。

在前期研究中（J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 7612-7620.），我们开发了一种基于自由基的催化烷基化方法，能够实现聚乙二醇（PEG）与缺电子烯烃的选择性C—H键官能化。为构建和筛选具有高质子传输活性的离子跨膜传输系统，我们采用该方法对PEG（分子量Mn = 6000）进行4-马来酰亚胺基苯甲腈官能化修饰。该一锅法光诱导铁催化反应表明，官能化程度（LOF）可通过调节反应时间加以控制。¹H NMR谱图显示，LOF在0至36小时内逐渐增加，之后在36至48小时间趋于平台期。采用凝胶渗透色谱法测定所得化合物的分子量（分别命名为P-2 h至P-48 h）。这些富氧聚醚类聚合物可形成多重氢键链（HBCs），从而能够选择性跨磷脂双分子层传输质子。所有合成步骤及表征数据见支持信息（图2A、S1和S10–S15）。如图1C所示，未修饰的PEG几乎无质子传输活性，与DMSO对照相当，而P-2 h至P-24 h样品则表现出可检测的传输能力。在反应最初的0–24小时内，LOF逐步增加（图1A），同时质子传输活性显著增强，在P-24 h时达到峰值，实现从“OFF”到“ON”状态的转变（图1D）。有趣的是，继续延长反应时间（24–48小时）所得的P-36 h和P-48 h，其质子传输活性丧失，与DMSO类似。即随着LOF的继续增加，体系又恢复到“OFF”状态。由于未修饰PEG具有亲水性特征，其无法嵌入疏水性脂质双分子层，因而无质子传输活性。适当的官能化修饰提高了PEG的亲脂性，从而促进了质子传输。然而，过度修饰导致疏水性过强，在水溶液中产生沉淀（图1E），阻碍了其嵌入磷脂膜，进而丧失传输活性。

图 1. 具有LOF依赖型传输活性的聚醚基质子传输系统。

为评估聚醚基传输系统的质子选择性，在内部为100 mM NaCl（pH 7.0）、外部为100 mM MCl（M = Li、Na、K、Rb、Cs，pH 7.6）的条件下进行了HPTS实验（图2A）。如图2B所示，P-24 h在不同MCl溶液中的传输活性波动甚微，表明其不转运碱金属离子。随后采用外部含100 mM KCl的LUVs进行实验（图2C），并加入缬氨霉素（Vln）以消除膜电位、促进H⁺/K⁺反向转运（图2D）。在300秒内，P-24 h（0.8 µM）和Vln（15 pM）单独作用时传输效率分别为24%和31%，二者联用后效率升至86%，表明P-24 h选择性传输H⁺而排斥Li⁺、Na⁺、K⁺等阳离子。光泽精实验证实P-24 h不转运Cl⁻。5(6)-CF实验表明其不促进水分子传输。综上，P-24 h选择性传输H⁺，同时有效排斥K⁺、Na⁺等阳离子，Cl⁻、Br⁻等阴离子及水分子。

图 2. 采用囊泡实验测试聚醚基质子传输系统的传输活性。

为解析该聚醚基质子传输系统的作用机制，我们在平面脂质双分子层上开展了膜片钳记录（cis/trans腔室均为0.25 M HCl，pH 0.6）。将P-24 h加入trans腔室后，典型方波状电流信号随即出现（图3A），表明其质子跨膜转运遵循通道型机制而非载体型机制。由I–V曲线拟合得到该通道的质子电导率（γH⁺）为97 ± 3 pS（图3D）。进一步考察了50 mV恒压下pH值（0.6–4）对电流的影响。结果表明，pH=1时电流幅值略低于pH=0.6（图3B）；在pH 1–3范围内，电流随pH升高而逐步减小；当pH升至4时，电流信号消失，可能归因于质子浓度过低。

图3. 确定P-24 h的传输速率和质子传输机制。

在验证了P-24 h在脂质体模型中快速、高选择性质子传输能力的基础上，进一步探究了其潜在的抗癌效应。首先采用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）法评估P-24 h对两种癌细胞系——恶性胶质瘤U87MG细胞和黑色素瘤B16F10细胞的细胞毒性。如图4A所示，在细胞培养基（DMEM）pH为7.4的条件下，即使P-24 h浓度高达32 µM，其细胞毒性仍几乎检测不到。鉴于癌细胞胞内pH约为7.2，推测跨细胞膜的质子梯度极小，不足以使P-24 h干扰细胞离子稳态。肿瘤微环境中癌细胞外pH约为6.4，远低于正常细胞胞外pH（约7.4）。为模拟该肿瘤微环境并考察跨膜质子梯度增强条件下P-24 h对癌细胞的细胞毒性，进行了同样的CCK-8实验。图4B显示，在培养基pH为6.4时，P-24 h对U87MG细胞表现出细胞毒性，其半数抑制浓度（IC50）为18.5 µM。由于正常细胞膜两侧几乎无质子梯度，P-24 h与大鼠肾细胞（NRK细胞）和小鼠胚胎成纤维细胞（3T3细胞）等正常细胞共孵育24小时后几乎不影响其活力（图4C）。上述结果表明，P-24 h可被癌细胞膜两侧显著的质子梯度激活，选择性地杀伤癌细胞而不影响正常细胞。

为确定P-24 h诱导癌细胞死亡的机制，采用Annexin V和碘化丙啶双染法对U87MG细胞进行流式细胞术分析。图4E显示，与P-24 h共孵育6小时后，早期凋亡和晚期凋亡U87MG细胞的比例分别为1.25%和25.2%，显著高于DMSO对照组（0.75%和3.54%），表明P-24 h通过细胞凋亡途径导致癌细胞死亡。

图 4. P-24 h选择性杀伤癌细胞的效果以及癌细胞凋亡机制研究

该论文第一作者为李聪博士后，通讯作者为jdb电子 刘俊秋教授、博士后吴雅琪和闫腾飞副教授，陕西师范大学曾荣教授作为共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金，科技部重点研发计划等项目的资助与支持。